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內毒素的檢測和去除
  • 發布日期:2018-01-18      瀏覽次數:1983
    • 1 內毒素及其來源   
      1.1 內毒素  
      內毒素(endotoxin)是存在于革蘭氏陰性菌細胞壁外膜表面的一種大分子物質,一般只有在細胞死亡或分解時自行釋放到周圍介質中,特殊條件下也可以從活細胞中直接泄漏出來。內毒素又被稱為熱原,是一種脂多糖物質,具有耐熱性,不易被去除。若疫苗中存在一定濃度的內毒素,接種動物后,可引起動物發熱,休克等,嚴重時甚至造成死亡。   
      1.2 內毒素的來源 
      因為革蘭氏陰性菌無處不在,所以內毒素幾乎存在于任何地方。在疫苗生產中一定要重視和盡可能減少內毒素的污染。 
      生產用水中內毒素的含量是導致疫苗安全性的關鍵因素之一。大量研究表明,疫苗生產過程中內毒素主要來源于培養液和配制用水,其在貯存過程中易受到革蘭氏陰性菌的污染。貯水罐,純水系統的過濾器和連接管道,以及培養液容器等都可能受到革蘭氏陰性菌的污染。  工作人員進出車間攜帶的物品,以及空氣凈化系統久不維護,都有可能造成生產車間內的空氣塵埃濃度升高,導致內毒素污染。 
      生產用具、管道、泵、閥門、濾器等的清洗消毒不*也會造成內毒素污染。生產原料的污染,如血液制品,細胞培養基。人為操作不規范也會引起內毒素污染。   
      2 內毒素的檢測 
      目前,內毒素的檢測方法較多,但是各存在利弊,因此,選取檢測方法要根據實際需求,不建議采取單一的檢測方法。  
       
      2.1 鱟試驗法 
      鱟試驗法是通過酶的級聯反應而實現,內毒素在二價陽離子的參與下激活C因子(FC),然后激活其它酶原,產生一系列凝集酶反應。該方法是目前檢測內毒素zui特異和zui靈敏的方法。  
      2.2 重組C因子法  
      重組C因子法是使用一個單一的蛋白(重組C因子)作為有效活性成分。反應中內毒素激活重組C因子,活化的重組C因子將熒光底物裂解,產生熒光復合物,定量檢測熒光復合物來量化內毒素。這種方法可有效避免假陽性的產生。該方法可用于藥品生產,環境,器械生產中的內毒素檢測。  
      2.3 熱原試驗法 
      該方法是比較廣泛的檢測熱原的方法,利用微量內毒素可引起動物體溫升高的特性來測試其含量。這種方法存在靈敏度低,無法定量測定,種屬差異大,周期長等問題。  
      2.4 其它方法   
      除了上述較常見的方法外,還有一些方法也被應用于內毒素的檢測,如免疫學方法(酶聯免疫吸附檢測法,火箭免疫電泳鱟試驗法,雙抗體夾心ELISA法等),生物學方法,化學發光法,流式細胞法,液相色譜法等。  
      3 內毒素的去除 

      一直以來,去除內毒素都是疫苗生產中的一個難題。其熱穩定性高,對PH值不敏感。目前,已有一些去除內毒素的方法,但其去除方法還有待進一步研究。  3.1 超濾法 
      利用內毒素與其他物質的分子量的差別來去除內毒素。一般在樣品流經超濾膜時,超濾膜將內毒素截留在膜上,而讓其它低分子量物質透過,從而有效控制內毒素的含量。超濾膜的內毒素去除率較高,變化范圍較寬,高達98.7%,低至53.3%。因熱原是一類形態和相對分子質量均不確定的物質,其種類,濃度也會有所不同,因此內毒素的去除率也是由多種因素所決定,如超濾運行的壓力,超濾濃縮的倍數,超濾洗脫的體積等。由于內毒素聚合體可能會在高溫或酸性環境中分解,進而造成內毒素分子的真正毒性部分類脂A穿過濾膜而進入濾液中。該方法去除內毒素,抗原損失較少,并且富集樣品,能夠滿足疫苗生產的要求。  
      3.2 活性炭法 
      該方法主要適用于水等組分簡單的小分子溶液的內毒素去除。因其選擇性能差,易吸附有效成分,一般較少用。該方法可與超濾法聯合使用去除內毒素的效果較佳。  
      3.3 熱處理法 
      該方法主要用于耐熱物品內毒素的去除。  
      3.4 化學降解法 
      使用強酸,強堿或氧化劑使內毒素自身降解,從而去除內毒素。  
      3.5 親和膜分離系統法 
      此法基于親和色譜法,以纖維素膜等做基礎材料,通過化學的方法鍵合不同的配基,這些配基對內毒素分子或聚集體有較強的吸附作用。此法吸附特異,吸附量大,去除率高,膜可再生,且具備一定的耐酸耐堿性。  
      3.6 其它方法 
      吸附技術和雙向萃取法也用于去除內毒素,但這兩類方法涉及的試劑,步驟較多,易造成污染,使用較少。

       

    魏經理
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